质粒DNA的提取、纯化及检测
姓名：XXX学号：2011001400XX年级：20XX级生物基地班 实验日期：2013年9月16日—30日组别：6组 同组者：XX
一、【实验目的】
1、掌握碱变性提取法提取大肠杆菌中质粒DNA的原理和方法。
2、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
3、学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
4、学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】
1、质粒DNA的制备方法
质粒（Plasmid）是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。
质粒DNA的制备包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。主要方法包括：碱裂解法：0。2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于质粒大量提取。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。
2、质粒DNA的提取——碱变性提取法
在细菌细胞中，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶pH值不同。在pH值高达12。0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。当用pH值4。6的KAc（NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀
DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
3、凝胶电泳进行DNA分离纯化
电泳（electrophoresis）是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA的片段，是分子生物学的核心技术之一。
凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（ethidium bromide，EB）或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。
分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸（5—500bp）的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0。1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β—D—吡喃半乳糖与3，6—脱水—L—吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104—105。琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40—45℃。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大（50至百万bp），小片段DNA（50—20000bp）最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA的片段，进一步纯化DNA等。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。
三、【实验材料】
1、实验仪器
培养皿、接种环、三角瓶、酒精灯、恒温振荡培养箱、50ml离心管、1。5ml塑料离心管（Eppendorf管）、高速离心机、漩涡振荡器、微量移液器、不同型号枪头、天平、制胶槽、梳子、电泳仪、吸管、量筒、微波炉、灭菌锅、恒温水浴锅、试剂瓶、卫生纸和记号笔、手套等。
2、实验试剂
LB培养基，抗生素Ap（氨苄青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液（10×），上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭（EB），DNA相对分子质量标准物DNA Marker λ/Hind Ⅲ，5mol/L pH 5。2的醋酸钠。
四、【实验步骤】
1、准备实验
配制LB液体培养基，分装到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配LB固体培养基；准备1000ul、200ul、10ul移液枪尖各一盒，1。5ml离心管若干于500ml三角瓶中，50ml离心管2个 ，将上述物品包好连同配好的培养基一同灭菌。
2、菌体培养
在含有Ap的LB平板上挑取一环携带有质粒pUC19的'E。coli DH5单菌落，接种于20mlLB液体培养基中进行37℃振荡过夜培养，培养基中加Ap100ul
（100ug/ml），质粒pUC19具有Ap抗性基因，使得带有pUC19的质粒得以生长。 过夜培养后菌体量大，杂质较多，然后用移液枪吸取过夜培养物2ml转接于50mlLB液体培养基中，培养基中加入Ap250ul，37℃振荡培养4—6h至对数生长期后期，生长速率快，代谢旺盛，酶系活跃，杂质少，适合提取质粒。
3、质粒提取
（1）称量空的50ml离心管的重量为14。331g，然后将三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒满，液面距管口约1cm，7000rpm离心5分钟后弃去上清液，收集菌体细胞。
（2）向离心管中悬滴加入5ml冰预冷的溶液Ⅰ打散菌体洗涤，用漩涡振荡器使之充分悬浮后用枪尖吹吸混匀，同步骤（1）离心，弃去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使上清液全部流尽干燥，然后称重得14。437g，则菌体质量为106mg。
（3）洗涤后每100mg菌体应加入冰预冷的溶液Ⅰ1ml，106mg菌体按100mg菌体处理，加入溶液Ⅰ1ml，打散菌泥、吹吸混匀，冰浴5min。溶液Ⅰ中的葡萄糖使
溶液密度增加，悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；维持渗透压，防止细胞提前破裂，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生长。Tris—Cl溶液提供适当的pH。
（4） 按比例加入新配制的溶液Ⅱ2ml（与溶液Ⅰ对应），轻加轻摇，冰浴5min。溶液变清亮透明粘稠如蛋清状。溶液Ⅱ中的NaOH使细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化导致细胞溶解。同时，强碱性使染色体DNA、质粒DNA和蛋白质变性；SDS为下一步沉淀做铺垫。
（5）按比例加入冰预冷的溶液Ⅲ1。5ml（与溶液Ⅰ、Ⅱ对应），轻加轻摇，冰浴10min。溶液出现白色絮状沉淀。沉淀为蛋白质SDS复合物、细胞碎片和其他大分子成分。溶液Ⅲ中的HAc中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断基因组DNA，只要是50－100 kb大小的片断，就不能再被PDS共沉淀。同时变性的质粒DNA复性。反应形成的高盐环境进一步加速了沉淀。
（6）12000rpm离心15min，白色沉淀聚集在离心管一侧，用移液枪将上清液转移到另一洁净的离心管中。然后向上清液中加入1/10体积的3MNaAc混匀，加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，—20℃下沉降30分钟。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。
（7） 以12000rpm离心15min，小心倒去上清液，得到DNA沉淀。加入3ml70%冰乙醇，轻轻地覆盖沉淀，不打散沉淀，洗涤一次。
（8）以12000rpm离心5min，离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。去掉上清液，将离心管上沉淀部位做好标记，将离心管倒置于吸水纸上，干燥5min。粗提取的质粒呈浅黄色，随着水分的减少质粒变为无色。所以为了完全溶解质粒，要在离心管上标记质粒所在位置。
（9）将DNA沉淀溶于1mlTE缓冲液中，移液枪吹吸助溶，然后将溶解液转移到一个Eppendorf管中。TE是pH缓冲液，为DNA提供稳定的生理状态，呈弱碱性，有利于保护碱基对。同时含有EDTA是二价阳离子的螯合剂，抑制DNA酶作用。
4、质粒纯化
（1）Eppendorf管中加入RNase A（纯浓度＞50ug/ml），37℃保温0。5—1h
（2）将上述的溶液平均分配到2个1。5ml的微量离心管中，每管0。5ml，分别加入与溶液等体积的（500ul）Tris饱和苯酚溶液，振荡混匀，7000rpm，离心5min，上清液转移到一洁净的Eppendorf管中。苯酚是经Tris饱和后的，显黄色。苯
酚加入后，溶液分层，苯酚向下，下层呈浅黄色，上层溶液无色，在中间产生大量白色沉淀，此为变性后的蛋白质。
（3）加入等体积的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1：1），振荡混匀， 7000rpm，离心5min，上清液转移到到另一洁净的Eppendorf管中。苯酚是强的蛋白变性剂，但是苯酚留在质粒溶液中会影响DNA的酶切，它本身易被氧化，会损伤质粒。氯仿也是蛋白变性剂，但是比酚弱，且能溶解质粒中的脂类，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫，有利于分层更明显。此时溶液中已看不到明显的白色沉淀，但仍有蛋白质的存在。
（4）加入等体积的氯仿溶液，振荡混匀， 7000rpm，离心5min，上清液转移到一洁净的Eppendorf管中，得上清液400ul。
（5）向上清液中加入1/10体积的NaAc混匀，再加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，—20℃下沉降30分钟。
（6）以12000rpm，离心15min，弃去上清液，得到DNA沉淀，为白色。
（7）向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗涤。然后以12000rpm离心5min，离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。
（8）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥。用50ulTE溶解于1管中。
5、质粒检测
（1）称取0。4g的琼脂糖，置于一锥形瓶中，在三角瓶上标好液面位置，加入40ml的1×TAE电泳缓冲液，再加入5—10ml重蒸水，以补充在溶胶过程中损失的水分。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。冷却至50℃左右，倒入制板槽制板。
（2）待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。在槽内加入1×TAE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面2—3cm。取1μl加电泳载样液和3μl质粒样品于小纸片上，用移液枪混匀。
（3）电泳1h，观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。
（4） 把胶槽取出，小心滑出胶块，放进EB溶液中进行染色，完全浸泡约5min。
（5）凝胶成像仪观察。
五、【注意事项】
（1）滴加溶液II时，要逐滴加入，且要轻加轻摇溶液使之混匀，整体动作要快，因为强碱在溶液中停留时间不能过长，否则会破坏质粒DNA。
（2）加入溶液III后，生成了大量的絮状沉淀，溶液III中和强碱使质粒复性，不可剧烈震荡， 防止染色体DNA断裂，应该上下颠倒离心管，使其混匀。
篇二：山东大学细胞生物学实验报告一，实验目的：
1，了解小鼠膜的剪取方法，以及小鼠的内部结构。
2，掌握并了解苏丹三染色的原理及方法。
3，理解苏丹Ⅲ脂类染色的基本原理。
二，实验原理：
脂类细胞化学的主要目的是研究细胞中脂类物质的成分变化以及分布。
在动物细胞中，脂肪是动物体主要的储能物质，很多种细胞都含有脂肪。
通常，细胞中的脂肪和类脂体混合物以游离的液滴状态悬浮在细胞质中，比
如肝细胞。在脂肪含量很高的脂肪细胞中，游离的脂肪液滴可以聚集在一起，
占据大部分细胞质空间，将细胞质、细胞核挤到细胞边缘。
脂类染色最常用的染料是苏丹系列染料，本实验即使用苏丹Ⅲ为脂肪显
色。苏丹Ⅲ是一种橙红色偶氮染料，由于其在脂肪中的溶解度高于在乙醇中
的溶解度，当用70%乙醇溶解的苏丹Ⅲ饱和溶液浸染脂肪细胞时，苏丹Ⅲ会
从70%乙醇中脱离，溶解并集中在脂肪液滴中，使脂肪细胞着色（橘黄色）。
以70%乙醇作为苏丹Ⅲ的溶剂可以减少乙醇对脂肪细胞中脂肪液滴的溶解，
染色较大的脂肪块。染色的主要过程不涉及化学变化。
三，实验器材及材料
1，器材 ：镊子两把 显微镜 托盘一个 剪刀一把 滴管一支 载玻片（盖
玻片）
2，试剂：苏丹Ⅲ染液 蒸馏水 70%乙醇 生理盐水 甲醛钙溶液 四，实验步骤：
1、断头法处死小鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，用镊子提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，用剪刀连同盖玻片和其上粘的肠系膜取下，反扣于已滴加甲醛钙的载玻片上，固定 20min。
2、用吸管吸取蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗掉甲醛钙溶液。
3、用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤二的操作，冲洗。
4、滴加苏丹Ⅲ于盖玻片上，染色30min。
5、吸去载玻片上溢出的染液，擦净载玻片表面及周边，显微镜观察。 五，实验结果及分析：
脂肪细胞呈圆球形，内充满橘黄色之类物质
由于肠系膜标本过厚，细胞染色效果起初不太明显，脂肪细胞渐渐变为橘黄色，可观察到清晰的脂肪细胞，但细胞分散程度较差，单细胞形态较为少见，细胞质较难观察的到。随着染色时间增长，基本可以分辨出脂肪滴与细胞质。六，实验总结：
1，制作肠系膜玻片时要注意去除血管组织，尽量将其压薄，便于后期染色，观察。
2，染色必要时可采取反扣盖玻片染色，以保证染色充分，均匀。 3，染色完后去除多余染液以便于观察。
篇三：山东大学微生物生理生化反应实验报告一、【实验目的】
1。 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2。掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3。了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4。掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5。 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。
二、【实验仪器与试剂】
菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌
培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖
发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄糖蛋白胨水培养基；
试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、
仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管
三、【实验原理】
1。在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
2。淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精，双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。
3。油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说明此中菌可产生分解油脂的酶。
4。 糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸，醋酸，丙酸等）和气体（如氢气，甲烷，二氧化碳等）;有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5。IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
（1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白
胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测
的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，
乙酸和乳酸等多种有机酸，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色，即甲基红反应。大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
四、【实验步骤】
1。 淀粉水解实验
（1）倒平板：按照淀粉培养基配方配制固体淀粉培养基，灭菌，待培养基冷却至50℃左右，在酒精
灯火焰旁倒平板，每组两个平板。 （2）用记号笔在平板底部划成四部分。
（3）接种：在无菌操作台上，将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在不
同的部分点种，如图一所示，注意仅用接种针接触极少面积的培养基，在平板的反面对应部分贴上标签，标签上分别写上菌名，以免混淆。 （4）培养：将平板倒置，在28℃温箱中培养两天。
（5）观察：取出培养基，观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，
轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察培养皿中菌落周围是否有无色透明圈，若有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，为阳性，反之则为阴性。记录实验结果。
图一：淀粉水解试验接种示意图图二：油脂水解试验接种示意图 2。油脂水解试验
（1）倒平板：按照油脂培养基配方配制固体油脂培养基，灭菌，待培养基冷却至50℃左右，充分振荡，
使油脂均匀分布，在酒精灯火焰下倒平板，每组两个平板。 （2）用记号笔在在平板底部划成四部分。
（3）接种：在无菌操作台上将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别划十字线接种于平板相对应部分的中心，如图二所示，并贴好标签，标签上注明菌种的名称。 （4）培养：将平板倒置，在28℃温箱中培养两天。
（5）观察：取出平板，观察菌苔颜色，如果出现红斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。记录实验结果。 3。葡萄糖发酵实验
（1）培养基的配制：按照糖发酵培养基配置葡萄糖发酵培养基，分装至试管中，用胶头滴管往德汉氏
小管中注满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要让德汉氏小管中进入空气，每组五只试管，灭菌。
（2）接种：待培养基冷却至常温时，在无菌操作台上，取葡萄糖发酵培养基试管2支接入大肠杆菌，
再取两只接入普通变形杆菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡，第五支不接种，作为对照。在各试管外壁上贴上标签，标签上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。
（3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28℃下培养两天。 （4）观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。4。乳糖发酵实验
（1）培养基的配制：按照糖发酵培养基配置乳糖发酵培养基，分装至试管中，用胶头滴管往德汉氏小
管中注满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要让德汉氏小管中进入空气，每组五只试管，灭菌。
（2）接种：待培养基冷却至常温时，在无菌操作台上，取乳糖发酵培养基试管2支接入大肠杆菌，再
取两只接入普通变形杆菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡第五支不接种，作为对照。在各试管外壁上贴上标签，标签上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。 （3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28℃下培养两天。 （4）观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。 5。吲哚试验
（1）培养基的配制：按照蛋白胨水培养基配方配制培养基，分装至试管中，每组五只试管，在高压蒸气
锅内灭菌。
（2）接种：待培养基冷却后，在无菌操作台上将大肠杆菌接入2支蛋白胨水培养基，产气肠杆菌接入2
支蛋白胨水培养基，剩余一只试管不接种，作为空白对照，贴好标签。
（3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28℃下培养两天。 （4）观察：往培养后的蛋白胨水培养基内加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试
管避徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。观察加入试剂后试管内的颜色反应并记录实验结果。6。甲基红试验
（1）培养基的配制：按照葡萄糖蛋白胨水培养基配方配制培养基，分装至试管中，每组五只试管，在高
压蒸气锅内灭菌。
（2）接种：待培养基冷却后，在无菌操作台上将大肠杆菌接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基，产气肠杆菌
接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基，剩余一只试管不接种，作为空白对照，贴好标签。 （3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28℃下培养两天。 （4）观察：培养两天后后，将每支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入2滴甲基红试剂，培养基变为红
色者为阳性，变为黄色者为阴性。观察试管内的颜色变化，并记录实验结果。
五、【实验结果及分析】
实验结果记录
淀粉水解试验：
油脂水解试验：
葡萄糖发酵培养基：
乳糖发酵培养基：
表4。 乳糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
吲哚试验：
甲基红试验：
淀粉分解实验结果 油脂分解实验结果
葡萄糖发酵实验结果乳糖发酵实验结果
文学网
